Secuenciación de regiones variables de RNA ribosomal 16S para estudiar la diversidad bacteriana

El RNA ribosomal 16S (o 16S rRNA) es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas procariotas. A los genes que la codifican se les llama 16S rRNA y se utilizan para reconstruir filogenias. 

La secuenciación 16S rRNA basada en NGS es una técnica que no precisa de cultivos para conocer la comunidad microbiana de tu muestra. Está basada en:

  • La presencia del gen 16S en todas las bacterias y la conservación universal de algunas regiones. Permite el diseño de pares de primers capaces de amplificar regiones específicas de practicamente todos los genes 16S bacterianos
  • La especificidad del gen 16S en algunas regiones variables hace posible la identificación de las bacterias a un nivel taxonómico suficientemente informativo

La utilidad y la relevancia de los estudios de 16S es enorme, pero el ensayo experimental y el análisis bioinformático son complejos y es importante considerar todos los aspectos para realizar un diseño del proyecto integral que nos reporte los mejores resultados. 

Estos puntos son cruciales para conseguir a través de la secuenciación 16S una identificación suficientemente específica de las bacterias: 

  • La cobertura de la secuenciación. Para detectar las bacterias que se encuentran en una menor concentración se necesita alcanzar una suficiente resolución o cobertura de la secuenciación. Las tecnologías NGS hacen este tipo de análisis posible ya que proporcionan un mayor rendimiento a un menor precio. 
  • La longitud de las reads. Cuanto mayor sea la longitud, más precisa será la asignación taxonómica. Si queremos que la asignación taxonómica llegue al nivel de la especie necesitamos encontrar secuencias específicas de esa especie que nos permitan inequívocamente identificar la presencia de cada una de las especies. Las secuencias más largas permiten que la asignación taxonómica llegue a rangos taxonómicos más específicos. 
  • La tasa de error de las secuencias. Las variaciones de la secuencia en las regiones variables de 16S son sutiles y los errores en la secuencia pueden ocasionar una falta de asignación (si la probabilidad del error que se espera no se considera correctamente) o una asignación inespecífica si los posibles errores se tienen correctamente en cuenta. 

Multiplexación del ensayo

Con los nuevos métodos de barcoding puedes secuenciar varias muestras en la misma run de secuenciación, mejorando así el costo-eficacia y el tiempo de obtención de los resultados de la secuenciación 16S. La multiplexación abre nuevas posibilidades de aplicación para el estudio de muchas tipos diferentes de muestras con objetivos también distintos que no podrían haberse abordado con los métodos tradicionales. 

PASOS de un proyecto de metagenómica 16S

PASOS de un proyecto de metagenómica 16S

Estos son los principales pasos en un proyecto de secuenciación 16S para muestras de metagenómica. 

  1. Muestreo y extracción del ADN

  2. Preparación de una librería 16S:

  • Amplificación por PCR de la región 16 rRNA a ser analizada
  • Barcoding del ADN para multiplexar el ensayo de secuenciación
  1. Secuenciación

  2. Análisis bioinformático

  3. Interpretación de los resultados​

Trabajamos para conseguir los mejores resultados en todos los pasos del proyecto. Podemos ayudarte en el diseño experimental de tu proyecto o bien seguir un diseño de tu elección previamente deifinido. 

Ofrecemos las mejores opciones de secuenciación considerando los objetivos de tu proyecto, el número de muestras y los requisitos de cobertura de la secuenciación, tiempos de entrega y presupuestos. 

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

Nuestro análisis es exhaustivo y específico para cada read ya que hacemos la asignación taxonómica para cada una de las reads secuenciadas. Hacemos la asignación basándonos en la similitude con secuencias 16S de nuestra base de datos de secuencias 16S de referencia. La precisión del método de asignación depende de: 

  • La precisión de la asignación taxonómica que tengan las secuencias 16S de referencia en la base de datos
  • La similitud con la secuencia de referencia de la que inferimos la asignación
  • El algoritmo de asignación

Nuestra nueva versión de MG7 es más avanzada y cuenta con una nueva base de datos de secuencias 16S y un algoritmo de asignación taxonómica más preciso. Ver descripción en Análisis de Microbiomas: MG7.

Resultados con MG7

Utilizando uno de los algoritmos de asignación taxonómica de MG7 signamos cada read secuenciada a un taxón del árbol taxonómico y te ofrecemos un completo conjunto de entregables con los resultados. 

Para que tengas distintas perspectivas de tus resultados, te ofrecemos 8 tipos distintos de valores de abundancia para evaluar las frencuencias y la abundancia de cada tipo de taxón bacteriano detectado: 

  • Algoritmo de asignación taxonómica Lowest Common Ancestor: 

    • Asignación Directa, Valores Absolutos
    • Asignación Directa, Valores Porcentuales
    • Asignación Acumulativa, Valores Absolutos
    • Asignación Acumulativa, Valores Porcentuales
  • Algoritmo de asignación taxonómica Best BLAST Hit 

    • Asignación Directa, Valores Absolutos
    • Asignación Directa, Valores Porcentuales
    • Asignación Acumulativa, Valores Absolutos
    • Asignación Acumulativa, Valores Porcentuales

Tablas de abundacia de taxa

  • Tablas de abundancia por muestra
  • Tabla global con todas las muestras para todos los rank
  • Tablas de abundancia para rank specíficos
  • Tablas de abundancia para cada grupo de muestras

Índices de diversidad

Calculamos el índice de  diversidad de Shannon-Wiener y el índice de diversidad de Simpson para cada muestra

Comparación entre grupos de muestras

Ofrecemos análisis estadísticos para el estudio de ldiferencias entre grupos de muestras . Usamos para ello herramientas en R basadas en software abierto de la red CRAN (The Comprehensive R Archive Network). En cada caso aplicamos los métodos más apropiados. Estos son algunos ejemplos del tipo de análisis estadístico que ofrecemos para los grupos de muestras:

  • Estadística univariante (análisis del fold change, t-tests, volcano plots, one-way ANOVA, análisis de correlación)
  • Estadística multivariante (análisis del componente principal, el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales)
  • Clusterización (dendrogramas, heat-maps, clustering de K-means, SOM)
  • Clasificación supervisada (random forests, support vector machine)

GRÁFICOS E INFORMES

  • Diferentes tipos de gráficas con la posibilidad de visualizaciones interactivas (Ver nuestro proyecto BIOGRAPHIKA sobre visualizaciones interactivas)
  • Resultados completos en formatos compatibles
  • Informes técnicos listos para la publicación científica​

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Ofrecemos gráficos interactivos (heat-maps, gráficos de barras, sunbursts, dendrogramas) con los que el cliente puede explorar de forma interactiva los resultados. 

Una vez el análisis bioinformático ha finalizado no hay nadie mejor que tú para interpretar los resultados. Sabemos que los resultados masivos no son fáciles de entender pero las visualizaciones gráficas interactivas pueden ayudarte a interpretarlos. Te ofrecemos visualizaciones interactivas y herramientas para explorar los resultados y definir nuevas gráficas con distintos parámetros que tú puedes seleccionar. 

Estamos continuamente añadiendo nuevas visualizaciones para ayudarte en el paso de interpretación.

 

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  •  info@era7.com

o rellenando el siguiente formulario



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