Perfil taxonómico con PacBio secuenciando el gen 16S entero

El ARN ribosomal bacteriano 16S es un gen complejo con 9 regiones variables. Las técnicas usuales de secuenciación masiva de 16S están basadas en la secuenciación de una o dos regiones variables de la subunidad 16S ya que usan tecnologías de reads cortas. De forma que con reads cortas  solo 2/9 de las regiones variables se usan en la determinación de taxa presentes en  la muestra

Usando PacBio se pueden analizar el 100% de las regiones hipervariables

Gracias al uso de tecnologías de secuenciación de read largas, se obtiene el gen completo en cada read (sin necesidad de ensamblaje) y por tanto, se cuenta con una alta especificidad y capacidad de resolución para llevar a cabo la asignación taxonómica basadas en diferencias de secuencia en el gen 16S.

Mayor especificidad en la asignación taxonómica con PacBio

En Era7 hemos desarrollado  un módulo específico de MG7 (nuestro sistema de análisis) para analizar el gen 16S completo. Este sistema ha sido probado usando secuencias de PacBio de BEI mock communities, obteniendo resultados muy buenos. En la mayoría de los casos hemos logrado asignar cada secuencia a nivel de cepa, que es el máximo nivel de especificidad que existe en el árbol taxonómico.

El uso de secuenciación 16S con PacBio para definir perfiles taxonómicos es posible gracias a un tipo especial de reads de PacBio que son las CCSs (Circular Consensus Sequences). Este tipo de secuencias de PacBio son lo suficientemente exactas como para permitir una asignación taxonómica muy fina.

Para obtener estas CCSs se usan insertos de pequeño tamaño dándole a la polimerasa la oportunidad de copiar varias veces la misma región de ADN. Estas diferentes copias de la misma región, obtenidas de la misma molécula de ADN, nos permiten obtener una secuencia  consensus correcta con una tasa de error mínima (la calidad final es de alrededor del 99%). Puedes ver una figura  sobre CCSs aquí.

Utilizando CCSs de PacBio se consiguen secuencias largas de alta calidad de muestras de metagenómica

Using CCSs (Circular Consensus Sequences) cada molécula de DNA puede secuenciarse varias veces dando varios pases y corrigiendo la secuencia final despues de alinear todas las copias de cada molécula.

Vea a continuación un esquema de la aproximación de CCSs de PacBio:

Aproximación de CCSs de PacBio

 

Esquema de la aproximación de CCSs de PacBio 

*1:  A SMRTbell™ template is a double-stranded DNA template capped by hairpin loops at both ends. The SMRTbell template is structurally linear and topologically circular. Key advantages of the SMRTbell template format include homogeneous, structure of the templates, efficient loading into ZMWs, and complementary, strand information in every molecule. This enables users to apply essentially the same protocol for generating templates of all size ranges. The hairpin adapters that are ligated to each fragment of DNA provide a common primer-binding site for the DNA polymerase. 

Definition of SMRTbell™ template taken from Pacbio documentation

Mayor universalidad en los primers del gen 16S completo

Otra ventaja de utilizar el gen 16S en toda su longitud es que los primers son más universales debido a que las regiones que flanquean al gen 16S están altamente conservadas. Esto nos permite amplificar bacterias raras que no se amplifican con los primers habituales los cuales tienen como diana las regiones variables.

Nuevas secuencias de referencia 16S con PacBio

Para aquellos clientes que trabajen en medios extremos con especies desconocidas PacBio es especialmente interesante ya que ofrece la posibilidad de obtener secuencias de referencia 16S (de la totalidad del gen) para esas nuevas especies.

Diferentes opciones del servicio PacBio

Si quieres que analicemos el gen 16S completo con PacBio puedes elegir dos opciones.

  • Enviarnos el ADN de tus muestras
  • Enviarnos las secuencias de las CCSs de PacBio correspondientes a los amplicones del gen 16S ya secuenciados.

 

 

Pregunta por este servicio por e-mail

  • info@era7.com

O rellenado el siguiente formulario

POLÍTICA DE PRIVACIDAD En cumplimiento con lo establecido en la legislación vigente en materia de protección de datos de carácter personal, Era7 Information Technologies SL le informa que los datos recogidos a través de este formulario serán tratados con la finalidad de enviarle información de su interés sobre nuestros productos, servicios y actividades. Así mismo, le informamos que los datos recogidos no serán comunicados a terceros salvo obligación legal y que en caso de autorizar la recepción de información por correo electrónico, sus datos podrán ser transferidos a servidores ubicados en Estados Unidos cuya empresa titular (The Rocket Science Group LLC – Mailchimp) se encuentra acogida al acuerdo de Privacyshield. Podrá ejercer los derechos de acceso, rectificación, cancelación u oposición a través de la dirección de email info@era7bioinformatics.com , así como a través de los medios detallados en nuestra Política de Privacidad.


Introduzca el texto que aparece en la imagen
* Campos obligatorios.